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质粒的制备
更新时间:2012-05-16      阅读:1834


 
电泳检验测定:质粒电泳普通有三条带,作别为质粒的超螺旋、开环、线型三种构型

吸光值检验测定:认为合适而使用分光光度计检验测定260nm、280nm波长吸光值,若吸光值260nm/280nm的比率介于1.7-1.9之间,解释明白质粒品质较好,1.8为*,低于1.8解释明白有氨基酸污染,大于1.8解释明白有RNA污染。

实验材料:包括质粒pUC18载体的结肠杆菌菌液,克隆有稻子外源断片的BAC的结肠杆菌菌液电热恒温鼓风干燥箱。

实验原理:在pH 12.0 ~ 12.6碱性背景中,球菌的线性大分子量染色体DNA改变性别分开,而共价闭环的质粒DNA固然改变性别但仍处于拓扑搅扰状况。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下,大多染色体DNA、大分子量的RNA和氨基酸在去污剂SDS的效用下形成沉淀,而质粒DNA还是为可溶状况。经过离心,可去掉除掉大多细胞碎片、染色体DNA、RNA及氨基酸,质粒DNA尚在上清中,而后用酚、氯仿抽提进一步醇化质粒DNA。

实验步骤:

1.取包括pUC18质粒的结肠杆菌菌液于LA营养物质上真空干燥箱37℃过夜培育;

2.汲取1.5 ml菌液,12000 g离心2分钟,使聚在一起菌体,倒掉菌液;汲取1.5 ml菌液,再次使聚在一起菌体,尽力将菌液倒整洁;

3.参加300 ml溶液 I振动打匀,从新悬浮细胞,震动混电热鼓风干燥箱匀(注意:应*打匀沉淀或碎块);

4.用无菌牙签儿挑取单菌落,接种于包括Amp抗生素的LB营养物质中,37℃摇床~250 r/min过夜培育;

5.参加300 ml溶液III颠倒混匀,安放于冰上10分钟,使杂质充分沉淀;

6.参加300 ml溶液II,轻柔颠倒混匀,安放至清脆,普通不超过5分钟;

7.12000 g离心10分钟;

8.汲取800 ml上清液(注意:不要汲取到漂浮的杂质)至另一Eppendorf管中,参加2/3大小的异丙醇,室温下安放5分钟干燥箱;

9.质粒、BAC的品质检验测定,于-20℃保留。

10.倒尽上清,加75酒精浸洗除盐(安放一会儿或离心3分钟后倒去上清);

11.12000 g 常温离心15分钟;

12.室温安放或超净台上风干DNA;

13.加40 ml灭菌超纯水或TE溶解;


 
 
 

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